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　　問題分析：超濾離心管常見問題

　　結(jié)果分析：

　　1. 蛋白在濃縮時出現(xiàn)了沉淀為什么?

　　蛋白如果濃縮過快或者過度濃縮都有可能引起蛋白沉淀。建議蛋白濃縮后的最終濃度不超過20mg/ml. 對于對濃縮速度敏感而容易沉淀的蛋白，建議的改進方法是：

　　1)離心力降為推薦離心力的30%-50%。

　　2)改選擇下一級過濾裝置(如原本選用10K，此時可以選擇30K)

　　3)在濃縮過程中，取出超濾管，用槍頭反復吹吸幾次。

　　2. 濃縮后發(fā)現(xiàn)濃縮液中沒有目的蛋白，可能的原因是?

　　首先，超濾管的起始蛋白濃度為25ug/ml.

　　請確保樣本的起始濃度大于這個濃度。

　　其次，如果問題仍然出現(xiàn)。

　　請不要丟棄您的樣本濾過液，

　　以做下一步分析：

　　1)如果樣本在濾過液中，那么請排查：

　　a) 是否選擇了合適截留分子量的超濾管(目的蛋白分子量的1/2或者1/3)?

　　b) 使用的離心力是否是在最高范圍內(nèi)?如果使用的是rpm，請換算成相應的g離心，

　　c) 離心機最近是否有校準過?

　　d) 是否嘗試這個蛋白?如果能確保用同樣的超濾管對其他蛋白成功操作的話， 那么有可能是目的蛋白的原因。有時蛋白會因其本身的一些特性(構(gòu)象差異)而影響濃縮效果，建議選用上一分子量級別的超濾管(如原本選用30K，此時可以選擇 10K)。

　　2)如果樣本也不在濾過液中：

　　a) 樣本起始蛋白濃度是否大于25ug/ml?

　　b) 用來確定樣本濃度的方法是什么?是否可信?

　　c) 目的蛋白是不是沉淀了?如果是，具體解決方法請參考上面的關(guān)于蛋白沉淀的相關(guān)解決方法。

　　3.用濃縮后的蛋白做下游分析時發(fā)現(xiàn)有干擾，可能原因?

　　裝置的超過濾薄膜含有微量甘油。如果此材料干擾分析，可用緩沖液或超純水預清洗。如果干擾仍然存在，用0.1 N NaOH清洗，然后用緩沖液或Milli-Q® 水再次清洗后甩干。

　　4. 有時候用超濾離心管連水都離不下來，可能原因?

　　裝置的超過濾薄膜含有微量甘油。如果出現(xiàn)這種情況，先用0.1 N NaOH清洗再離心。最后用緩沖液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應立即使用， 如暫時不用，請保持潤濕狀態(tài)，避免重新干燥。

　　5.使用超濾管對蛋白進行濃縮的過程中懷疑目的蛋白和膜之間可能存在非特異性吸附，如何改善這一現(xiàn)象?

　　超濾管使用的是再生纖維素膜的材質(zhì)，擁有極低的蛋白吸附能力。但是對于一些疏水性蛋白或非極性蛋白，它們和膜的非特異吸附可能會增強，對于這種情況，客戶可以嘗試在實驗前對超濾管進行封閉處理，詳細步驟可聯(lián)系廠家技術(shù)支持。

　　同時也可建議換成Amicon Ultra 0.5來進行實驗，通過減小膜面積來降低非特異性吸附。

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